因此隨著對(duì)酵母降解精氨酸產(chǎn)生尿素的分子生物學(xué)水平的研究，國(guó)外研究人員進(jìn)行了許多減低尿素分泌的

氨酸是通過尿素循環(huán)途徑實(shí)現(xiàn)的ｆ】２。１４】。見圖ｌ。

萬(wàn)方數(shù)據(jù)

董莖全��！蕉：煎塑塑主叁叁里墮芻墼絲墅盛墊堡墾墅墮旦查

代謝途徑存有爭(zhēng)議。后來，Ｌｉｕ

Ｓ

＿

Ｑｐ，２７１通過研究證明，ＭＬＢ

酵母工程菌的研究。試圖通過改變酵母基因以減少尿素的分泌，對(duì)降低酒中ＥＣ含量有著巨大的促進(jìn)作用。ＰＡＲＲ等利用反義干擾技術(shù)構(gòu)建低精氨酸酶活性的葡萄酒酵母菌株【１刀；Ｋｉｔａｍｏｔｏ［１８。１卯等利用同源重組原理敲除２

直至２０世紀(jì)９０年代，研究者仍對(duì)ＭＬＢ的精氨酸

對(duì)精氨酸的降解不是尿素循環(huán)途徑，而是精氨酸代謝途徑，即精氨酸脫亞氨基酶途徑（Ａｒｇｉｎｉｎｅ

ｄｅｉｍｉｎａｓｅｐａｔｈ一

個(gè)ＣＡＲｌ的等位基因構(gòu)造精氨酸酶基因缺陷性，獲得低

產(chǎn)尿素的清酒酵母菌株，酒液即便經(jīng)過６個(gè)月的貯存，ｗａｙ，簡(jiǎn)稱ＡＤＩ途徑），并通過實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到了與ＭＬＢ精氨酸代謝有關(guān)的３個(gè)關(guān)鍵酶：精氨酸脫亞氨基酶（Ａｒｇｉｎｉｎｅ

ｔｒａｎ一

ＥＣ含量也無(wú)明顯上升。Ｙｏｓｈｉｕｃｈｉ和Ｓｃｈｅｈｌ【�。钡确謩e利ｄｅｉｍｉｎａｓｅ。ＡＤＩ）、鳥氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶（Ｏｍｉｔｈｉｎｅ

用單細(xì)胞融合技術(shù)培育不產(chǎn)尿素的清酒和蒸餾酒酵母菌株。Ｄａｈａｂｉｅｈ通過“自克隆技術(shù)”．分別過表達(dá)釀酒酵母控制降解尿素途徑的ＤＵＲｌ，２基因及攝取尿素進(jìn)入細(xì)胞的ＤＬ刀陷基因。構(gòu)建出相應(yīng)工程菌并用于日本清酒發(fā)酵，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)ＤＵＲｌ，２基因的菌株所發(fā)酵生產(chǎn)的清酒中ＥＣ含量能夠減少８７％．雨過表達(dá)ＤＵＲ３基因的菌株則只能使ＥＣ減少１５％１２３１。２００６年，致力于遺傳改

良酵母菌種的生產(chǎn)商——加拿大Ｆｉｒｓｔ

ＶｅｎｔｕｒｅＴｅｃｈｎｏｌｏ—

ｇｉｅｓ公司宣布成功將脲酶基因轉(zhuǎn)人葡萄酒酵母細(xì)胞．這些酵母菌可以使葡萄酒中的氨基甲酸乙酯的含量降低８９％．２００７年ＦＤＡ批準(zhǔn)了該公司改造的葡萄酒酵母ＥＣＭ００１菌株投入商業(yè)運(yùn)營(yíng)。王德良洲等通過Ｈｅ－Ｎｅ激

光和亞硝基胍復(fù)合誘變法篩選得到了ｌ株ＣＡＲｌ突變型

低產(chǎn)尿素黃酒酵母菌株，使發(fā)酵液中尿素含量下降了５２．１５％。朱旭亞１２５］通過同源重組方式將ＤＵＲｌ，２基因整

合到黃酒酵母基因組中。獲得菌株８５哪舊．再將其與出

發(fā)菌８５＃進(jìn)行黃酒釀造實(shí)驗(yàn)．結(jié)果表明。酒體中尿素和ＥＣ含量分別比出發(fā)菌株降低了６９％和４ｌ％。雖然通過以上各種方法構(gòu)建的菌株在降低氨基甲酸乙酯含量方面取得了一定的成效，但仍然存在一些缺陷，除了不能完全消除發(fā)酵酒中的氨基甲酸乙酯外．有的還可能會(huì)影響到菌株的發(fā)酵速度，而有的利用基因中斷法雖然能破壞精氨酸酶基因。但實(shí)驗(yàn)中在中斷精氨酸酶基因的同時(shí)，引入了抗性篩選標(biāo)記基因，這使得構(gòu)建的酵母菌株無(wú)法在食品工業(yè)中得到推廣應(yīng)用。因此。用非抗性篩選標(biāo)記替代抗性篩選標(biāo)記來構(gòu)建精氨酸酶基因缺失的基因工程菌是基因工程菌發(fā)展的一個(gè)方向．同時(shí)在生產(chǎn)中還需要考慮發(fā)酵性能的保持、工藝條件的適應(yīng)性、酒體風(fēng)格的獨(dú)特性等方面的表現(xiàn)。

１．２葡萄酒ＭＬＢ的精氨酸脫亞氨基酶途徑

葡萄酒釀造中，在酒精發(fā)酵結(jié)束后。一般要進(jìn)行蘋果酸一乳酸發(fā)酵（Ｍａｌｏｌａｃｔｉｃｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，ＭＬＦ）。ＭＬＦ是在蘋果酸乳酸菌ＭＬＢ的作用下。將雙羧基的Ｌ一蘋果酸脫

羧基轉(zhuǎn)變成單羧基的Ｌ一乳酸的過程。ＭＬＦ在降低葡萄

酒酸度、改善葡萄酒風(fēng)味和增加葡萄酒微生物穩(wěn)定性等方面具有重要意義閉。而ＭＬＢ的精氨酸代謝會(huì)導(dǎo)致中間代謝物瓜氨酸的分泌。

萬(wàn)方數(shù)據(jù)

ｓｃａｒｂａｍｙｌａｓｅ。ＯＴＣ）和氨基甲酰激酶（Ｃａｒｂａｍａｔｅ

ｋｉｎａｓｅ，

ＣＫ）ｏ

Ｌ一精氨酸＋Ｈ２０———?Ｌ一瓜氨酸＋Ｎｉｌ３

精氨酸脫亞氨基酶（ＡＤＩ）

Ｌ－瓜氨酸＋Ｐｉ一氨基甲酰磷酸＋Ｌ一鳥氨酸鳥氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶（ＯＴＣ）

氨基甲酰磷酸＋ＡＤＰ—ＡＴＰ＋ＮＨ３＋Ｃ０２

氨基甲酰激酶（ＣＫ）

圖２葡萄酒中蘋果酸乳酸茵的精氨酸代謝途徑

在ＭＬＢ的精氨酸代謝途徑中．除了形成氨和鳥氨酸外，還有少量中間代謝物瓜氨酸分泌出來。Ｍｉｒａ

ｄｅ

Ｏｒｄｕｎａ［２ｓ－２９］等研究發(fā)現(xiàn)，在一定ｐＨ值下，ＭＬＢ分泌瓜氨酸的量與培養(yǎng)基中精氨酸的初始量存在線性回歸關(guān)系。目前．瓜氨酸的積累和分泌機(jī)制尚不十分清楚，有人認(rèn)為可能是因?yàn)榫�氨酸由ＡＤＩ水解形成瓜氨酸的速率比ＯＴＣ作用于瓜氨酸形成鳥氨酸和氨基甲酰磷酸的速率快；也有人認(rèn)為。瓜氨酸分泌可能是因?yàn)楣习彼岷铣珊头纸夥磻?yīng)之間能量的解偶聯(lián)作用。特別是細(xì)胞生長(zhǎng)到穩(wěn)定期之后，細(xì)胞生長(zhǎng)逐漸減慢或停止，而培養(yǎng)基中精氨酸過量，精氨酸降解產(chǎn)生的ＡＴＰ不被細(xì)胞利用而積累，因此抑制了ＯＴＣ的活性。因此，經(jīng)ＡＤＩ途徑降解精氨酸的微生物具有形成且分泌瓜氨酸的特點(diǎn)，這對(duì)葡萄酒釀造具有重大意義．因?yàn)榉置诘墓习彼峥梢院鸵掖甲园l(fā)反應(yīng)生成氨基甲酸乙酯。

ＭＬＢ的精氨酸代謝及瓜氨酸分泌具有菌株特異性【ｌｏ刀瑚一，在進(jìn)行葡萄酒ＭＬＢ降酸時(shí)，應(yīng)選擇沒有精氨酸代謝或代謝中沒有瓜氨酸分泌的菌株。即ＡＤＩ酶活高、ＯＴＣ活力低的菌株不能用于生產(chǎn)，以盡量降低葡萄酒中氨基甲酸乙酯的含量。李華【３ｌＪ等分離篩選出了我國(guó)優(yōu)良的０．ｏｅｎｉ菌株，但對(duì)其進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，ＭＬＦ后的

葡萄酒中精氨酸含量仍然很高（６～１０ｍｇ／Ｌ）。法國(guó)和阿

根廷已經(jīng)完成０．ｏｅｎｉ和Ｌ．ｈｉｌｇａｒｄｉｉ的ａｒｅ簇基因全序列測(cè)序，這將為我國(guó)ＭＬＢ的精氨酸代謝研究提供更多的信息【３２】。１．３其他途徑

一些葡萄酒生產(chǎn)商發(fā)現(xiàn)。在裝瓶時(shí)檢測(cè)ＥＣ為陰性，但經(jīng)過貯藏和運(yùn)輸環(huán)節(jié)后，酒中的ＥＣ含量超過了

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１００“ｇ／Ｌ。Ｍｕｌｌｅｒ＿［３，】等研究發(fā)現(xiàn)，葡萄酒釀造中，雙乙酰和尿素反應(yīng)生成的３ａ，６ａ一二甲基甘脲（３ａ，６ａ—ｄｉｍｅｔｈｙｌｇｌｙｃｏｌｕｒｉｌ．ＤＭＧＵ）也是ＥＣ的前體物質(zhì)．ＤＭＧＵ和乙醇反應(yīng)生成ＥＣ主要發(fā)生在裝瓶后，而且葡萄酒中ＥＣ濃度和ＤＭＧＵ的量有關(guān)。因此，雙乙酰和尿素反應(yīng)生成ＤＭＧＵ是葡萄酒中ＥＣ產(chǎn)生的另一條途徑。

此外．還有研究表明．尿素與乙醇合成ＥＣ的量與溫度有關(guān)，隨著溫度的升高，ＥＣ的生成量增大［３４，３５】。同時(shí)，在６０～１００℃的乙醇水溶液中，尿素能被分解為異氰酸鹽和氰酸鹽，它們分別都能在酸性環(huán)境中與乙醇反應(yīng)生

成ＥＣ［３６～３７

３８］。

ＮＣ０’＋Ｃ２Ｈ５０Ｈ＋Ｈ＋—｝Ｃ２Ｈ５０ＣＯＮＨ２

另外。在蒸餾酒如白蘭地的蒸餾過程中，高溫會(huì)使一部分尿素受熱分解生成氰酸，隨后生成的氰酸會(huì)與酒精反應(yīng)生成ＥＣｌ３６．３９］。

熱分解

＋Ｃ２Ｈ５０Ｈ

２影響葡萄酒中ＥＣ含量的因素

Ｈ２ＮＣＯＮＨ２一ＮＨ３＋ＨＯＣＮ—Ｈ２ＮＣ０２Ｃ２Ｈ５

葡萄酒中ＥＣ的形成主要和葡萄汁中精氨酸濃度有關(guān)［４０ｌ。Ｇｕ［４１】和Ｓｏｕｆｌｅｒｏｓ［４２１等研究了葡萄品種中砧木、修剪、灌溉及土壤施肥等對(duì)葡萄汁精氨酸濃度及葡萄酒中ＥＣ濃度及潛在濃度的影響，結(jié)果表明，葡萄栽培管理方法對(duì)葡萄汁中精氨酸濃度有很大影響，尤其重要的是葡萄汁中精氨酸濃度與葡萄酒中ＥＣ含量存在著很大的相關(guān)性。２．１施肥

葡萄園的氮肥對(duì)葡萄汁中的氮含量有直接的影響。Ｓｐａｙｄ等【４３刪研究表明，隨著施氮量的增加，葡萄葉柄部的硝基氮含量增加，并且葡萄汁中精氨酸的含量與氮肥施用量成正比，把收獲的葡萄釀酒，葡萄酒中的尿素含量也與氮肥施用量呈正比。一般情況下，如果精氨酸含量超過１０００ｍｇ／Ｌ，就可以認(rèn)為葡萄園地所施氮肥過量。２．２地面覆蓋作物

用豆科植物作為地面覆蓋作物時(shí)，可明顯增加葡萄果實(shí)中氮的含量。一些豆科作物，如ｖｅｔｃｈｅｓ（Ｖｉｃｈｉａｓｓｐ），ｃｌｏｖｅｒ（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍｓｓｐ）和ｐｅａ（Ｐｉｓｕｍｓｓｐ）等作為葡萄園地面覆蓋作物時(shí)，會(huì)使葡萄藤中氮含量明顯增加，而葡萄藤中氮含量與葡萄汁中精氨酸含量有很大的相關(guān)性。２．３葡萄品種和砧木

Ｈｕａｎｇｔ４５】等研究了葡萄園位置、葡萄品種及砧木對(duì)葡萄汁中氨基酸含量的影響。結(jié)果表明，葡萄品種不同，對(duì)氮的吸收也不同。低氮品種主要與其植株根系的特性有關(guān)，使用不同的砧木，其含氮量會(huì)發(fā)生變化。Ｇｕｔ４１１等研究發(fā)現(xiàn)．不同的砧木品種產(chǎn)生的葉柄硝基氮含量不同，從而

萬(wàn)方數(shù)據(jù)

會(huì)導(dǎo)致葡萄汁中精氨酸含量有所不同。因此，砧木對(duì)葡萄園的氮含量和施肥管理有著極其重要的影響。另外，葡萄汁的含氮量與葡萄園的位置、土壤、灌溉、葡萄收獲時(shí)的天氣以及葡萄成熟度等也有關(guān)系。

另外，ＥＣ的形成還與葡萄酒釀造時(shí)加入的營(yíng)養(yǎng)劑以及貯藏溫度和時(shí)間等有關(guān)。

２．４葡萄汁營(yíng)養(yǎng)添加劑

在酒精發(fā)酵過程中，因酵母生長(zhǎng)繁殖的需要，葡萄汁中應(yīng)含有一定量的含氮化合物，否則會(huì)造成酵母發(fā)酵中途終止。研究表明，發(fā)酵時(shí)加入氮源，如磷酸氫二銨，能明顯加快發(fā)酵速率，防止發(fā)酵“阻滯”㈤。然而，Ｖｉｒｇｉｎｉａｔ４ｎ研究表明．如果添加過量的磷酸氫二銨會(huì)導(dǎo)致尿素的形成，并被酵母分泌到葡萄酒中。因此，他認(rèn)為添加過量的磷酸氫二銨也是導(dǎo)致ＥＣ形成的一個(gè)因素。Ｉｎｇｌｉｓｔ４８１研究發(fā)現(xiàn)，不同的酵母菌株產(chǎn)生ＥＣ的量與加入磷酸氫二銨的時(shí)間有關(guān)．有的菌株發(fā)酵時(shí)加入的時(shí)間越早，ＥＣ產(chǎn)生量越少，而有的菌株ＥＣ產(chǎn)生量與磷酸氫二銨的加入時(shí)間沒有太大關(guān)系。

２．５帶酒腳陳釀

在白葡萄酒釀造工藝中，為了使葡萄酒風(fēng)味特征更突出，一般在發(fā)酵結(jié)束以后帶酒腳陳釀。由于酵母的自溶．在貯藏期間含氮化合物會(huì)逐漸從細(xì)胞中釋放出來湖。

據(jù)報(bào)道．氨基酸含量低的葡萄釀造的葡萄酒，延長(zhǎng)與酒泥的接觸時(shí)間。ＥＣ的含量并沒有增加，并且在陳釀期間．也沒有其他的ＥＣ前體從酵母中釋放【４９】。因此，如果葡萄汁中含氮量低，即使延長(zhǎng)酒泥的接觸時(shí)間，也不會(huì)增加ＥＣ的潛在性．反之亦然。ＭａｕｒｉｃｉｏｔＳｏ］等研究表明，在帶酒腳陳釀過程中。尿素的積累具有菌株特異性，并和陳釀期間的通氧情況也有關(guān)系，如果陳釀期間處于通風(fēng)狀態(tài)，尿素被大部分降解，則會(huì)減少尿素的積累。２．６發(fā)酵與貯藏溫度